媛禧生物客户高分文献系列解读（三）

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2023年8月25日，复旦大学附属华山医院董琼珠/钦伦秀/傅德良教授等课题组合作在Med（IF=17.0）杂志发表了一篇题为“Single-cell mapping reveals several immune subsets associated with liver metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma”的文章，研究采用质谱流式细胞技术（CyTOF）分析PDAC不同疾病阶段原发肿瘤免疫微环境特征，发现与PDAC转移相关的特异性CD4+T细胞亚群和巨噬细胞亚群，并通过多重荧光免疫组化（mfIHC）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行了验证，最后发现两种细胞亚群与PDAC患者转移及预后密切相关。

其中，文中的WiSee7色多重荧光试剂盒、多重荧光免疫组化染色服务、HALO分析由上海媛禧生物提供。

胰腺癌是消化道常见恶性肿瘤之一，PDAC是胰腺癌的主要类型，约占胰腺癌的90%。PDAC恶性程度高，5年生存率不到12%，治疗效果差。转移是PDAC最重要的生物学特征，也是导致临床疗效极差的主要原因，85％的PDAC癌患者确诊时已有局部淋巴结或远处脏器转移。目前晚期PDAC患者的治疗策略有限，与其他癌症相比，PDAC患者很难从免疫治疗中获益。因此深入探讨PDAC转移相关的免疫微环境特征，有助于PDAC患者的精准治疗。

图1 研究设计

该团队首先采用高通量质谱流式（CyTOF）对11例不同疾病阶段的PDAC患者（可切除/交界性可切除：4例；局部转移：3例；肝转移：3例）的原发肿瘤、淋巴结和血液样本进行了深入分析。结果表明，PADC患者血液、淋巴结和原发肿瘤中存在显著的免疫谱系差异。在此基础上，研究人员对患者原发肿瘤微环境中免疫细胞亚群进行分析，发现肝转移组患者原发肿瘤组织中CD103+PD-1+CD4+ T细胞以及CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞亚群的比例显著低于可切除组；而且肝转移患者肿瘤组织中存在CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞亚群，其比例显著高于可切除患者。对这11例PDAC的原发肿瘤进一步进行多重免疫荧光（mfIHC）分析证实了CyTOF的发现，提示特定的CD4+ T细胞和巨噬细胞亚群可能与PDAC转移密切相关。

该研究团队进一步利用已公开发表的16例PDAC患者的17个样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行挖掘，发现相比于未发生转移的PDAC患者，转移组的原发肿瘤组织中CD103+PD-1+CD4+ T细胞比例明显降低而CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞比例显著升高，进而验证了CyTOF结果。同时，研究人员发现这两群免疫细胞的功能状态明显不同， CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞高表达TIGIT、LGALS9和CTLA4等，具有明显的细胞毒性和耗竭状态。CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞高表达TPM4、CA12/2、 MMP7/8/9、CTSL、CCL2/7、SPP1、FN1、G0S2、IL1RN、SLC2A1、TGM2等，倾向于M2型状态。作者研究团队发现，CD103+PD-1+CD4+ T细胞和CD73+巨噬细胞存在多种互作受体-配体相互作用，包括TIGIT-PVR、OPN-CD44等。提示这两群细胞可能协同调控PDAC转移，为抗转移治疗提供依据。

最后研究人员结合临床209例PDAC患者肿瘤组织样本，利用mfIHC分别分析CD103+PD-1+CD4+ T细胞及CD73+巨噬细胞与临床病例特征和预后的关系，发现这两群细胞与PDAC患者转移及生存显著相关。

该研究探讨了PDAC不同进展阶段的免疫状态，揭示了PDAC转移相关的免疫细胞亚群。发现CD103+PD-1+CD4+T细胞与CD73+巨噬细胞可能参与调控转移相关免疫微环境的改造，并与PDAC患者预后相关。这些发现为研究与癌症转移相关的免疫调控网络提供了新的见解，有望为PDAC患者的精准治疗提供指导。

图2 特异性细胞亚群及其作用机制模式图

研究成果

1、CyTOF发现与转移相关的T细胞亚群及巨噬细胞亚群

首先，研究人员采用CyTOF对11例PDAC患者的原发肿瘤、淋巴结和血液样本的43个蛋白marker进行检测，结果发现PADC患者血液、淋巴结和原发肿瘤中存在显著的免疫谱系差异。在此基础上，研究人员对患者原发肿瘤微环境中免疫细胞亚群进行分析，发现肝转移组患者原发肿瘤组织中CD103+PD-1+CD4+ T细胞以及CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞亚群的比例显著低于可切除组，而且肝转移患者肿瘤组织中存在CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞亚群比例显著高于可切除患者。结果提示微环境中特定的CD4+ T细胞和巨噬细胞亚群在PDAC转移过程中发挥关键作用。

图3 CyTIF发现与转移相关的T细胞亚群及巨噬细胞亚群

2、mfIHC验证CyTOF结果

随后，研究人员通过肿瘤组织芯片对这11例PDAC进行mfIHC分析，采用T细胞亚型Panel-7指标（CD8、CD4、CD103、PD1、CD39、TIGIT、PVR）和巨噬细胞亚型Panel-4指标（CD36、Integrin 6、CD169、CD68），分别检测PDAC患者中CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞浸润和CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞亚群的分布情况，发现与CyTOF分析结果一致。研究同样提示微环境中特定的CD4+ T细胞和巨噬细胞亚群在PDAC转移过程中发挥关键作用。

图3 mfIHC染色

图4 通过HALO分析mfIHC结果验证CyTOF结果

3、scRNA-seq验证CyTOF结果

研究人员利用已公开发表的16例PDAC患者的17个样本的scRNA-seq数据进行挖掘，发现相比于未发生转移的PDAC患者，转移组的原发肿瘤组织中CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞比例明显降低而CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞比例显著升高，进一步验证了CyTOF结果。研究还通过CellChat互作分析发现，CD103+PD-1+CD4+ T细胞和CD73+巨噬细胞存在多种互作受体配体对，包括TIGIT-PVR、OPN-CD44等，揭示两种细胞之间的多种配体-受体相互作用。经mfIHC验证，CD4+ T cells 表面的TIGIT和CD68+巨噬细胞表面的PVR确实存在潜在的相互作用，提示这两群细胞可能协同调控PDAC转移。

图5 scRNA-seq验证CyTOF结果

4、mfIHC检测两种细胞亚群并揭示其与PDAC预后相关

最后，研究人员结合临床209例PDAC患者肿瘤组织样本，利用mfIHC分析CD103+PD-1+CD4+ T细胞及CD73+巨噬细胞与临床病例特征和预后的关系，同样发现在转移性PDAC肿瘤组织中CD103+PD-1+CD4+T细胞亚群浸润较低，而CD73+巨噬细胞亚群浸润较高。Kaplan-Meier分析显示，CD103+PD-1+CD4+T细胞比例高的PDAC患者整体生存率高于比例低的患者，而高CD73+巨噬细胞浸润的PDAC患者预后较差。结果表明这两群细胞与PDAC患者转移及生存显著相关。