文献解读 | 单细胞RNA-seq解析肝细胞癌中CTCs的空间异质性及免疫逃逸机制
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文献解读 | 单细胞RNA-seq解析肝细胞癌中CTCs的空间异质性及免疫逃逸机制
复旦大学附属中山医院樊嘉院士团队于2021年在《Nature Communications》期刊发表题为"Dissecting spatial heterogeneity and the immune evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma"的论文，通过对肝细胞癌（HCC）患者血管4个不同部位（肝静脉、周围动脉、周围静脉、门静脉）的CTCs进行单细胞转录组测序，描述了血液传播过程中CTCs转录组的动态变化，并进一步研究了CTCs可塑性的分子机制。团队还通过体内外测试验证了CTCs能够通过CCL5来募集Tregs分子，并在血液运输的过程中建立有利于转移的微环境。
肝癌是全球第二大癌症相关死亡原因，死亡率极高，其中肝细胞癌（HCC）占病例的90%，虽然目前HCC的监测和治疗策略已得到完善，但由于其高复发率和高转移率，HCC的临床治疗效果仍然亟需提高。而血源性传播是HCC转移的主要途径，因此，亟需深入研究HCC的发生机制以提高肝癌患者的临床疗效。循环肿瘤细胞（CTCs）是HCC中肝内和肝外转移的“种子”。在传播过程中，CTCs会受到血液微环境的影响，因此，针对性地研究CTCs及其在血液扩散过程中的变化，有助于发现肿瘤转移的新机制，为发展更有效的肝癌抗转移治疗策略提供了可能。
图1b为CTC与白细胞（white blood cell,WBC）的荧光成像图，将EpCAM或 pan-CK阳性、以及CD45阴性作为筛选CTCs的标准。经分析，相比较WBC，CTC显示出了拷贝数变异（copy number variation，CNVs）（图1c），证明了筛选的准确性。随后，作者对CTCs、原发肿瘤和HCC细胞系进行无监督分类，发现细胞可被成功分为3个细胞亚群（图1d）。通过基因集富集分析（GSEA）鉴定CTCs上调的分子通路 （图1e）。其中，67%的CTCs与侵袭和转移相关的基因表达量明显上调；编码能量代谢重编程蛋白的基因，在大多数CTCs中高度富集；趋化因子信号通路包括CCL5、CXCL5和CXCL3也在CTCs中明显上调。
图1 基于RNA-seq表征的CTCs、原发灶和HCC细胞系之间的基因表达差异
从患者不同血管位点分离出的CTCs按照患者来源类聚，患者间的异质性要高于血管间的异质性（图2a）。患者P9的CTCs在HV位点具有显著的异质性，在PA中降低（P <0.001），以及在PV和PoV中增加（P <0.001），这种空间异质性在另外5位患者身上得到了进一步的证实（图2b）。图2c描述了肝细胞癌CTCs传播的血流路径。对各血管位点CTCs特异性表达的基因进行富集显示：HV主要表达氧化磷酸化/外源性代谢相关基因；PA主要表达与GPRC信号传导相关的基因；PV主要表达免疫应答/细胞因子产生相关基因；PoV表达细胞周期相关基因（图2d）。这些结果表明，来自不同血管的CTCs在其转录谱中显示出明显的血管内/间异质性，暗示着在血液运输过程中，诸如血液动力学压力，细胞因子和免疫细胞的相互作用以及氧气/营养物质的剥夺等生物和物理诱因，会不断地调节CTCs表型的多样性。
PA的CTCs转录活性降低，而PV和PoV的CTCs转录活性增加（图3a）。最显著的变化发生在HV的CTC和PA的CTCs之间，下调的基因明显富集于有关细胞生长和增殖的通路。静脉血管CTCs中，MYC靶点和G2/M检查点通路相关基因再次上调（图3b），并且过度表达缺氧相关基因，将自身重编程为缺氧表型以应对缺乏氧气的环境（图3c）。CTCs亚群显示出高度表达的细胞周期特异性特征（图3d）。从HV到PA，CTCs中上调的基因强烈地富集于补体蛋白、EMT、血小板激活和趋化因子信号传导。值得注意的是，从HV到PA，与EMT相关的基因（SPARC，IGFBP2）、肿瘤细胞-血小板微聚集物形成相关基因（GP1BA，VWF）和免疫抑制趋化因子相关基因（CCL5，CXCL5）的表达增加，并且在PV和PoV中保留了他们的高表达水平（图3e）。
图3 单CTCs转录组的动态变化突显了循环过程中应激反应和细胞周期异质性的通路改变
差异表达分析显示免疫抑制趋化因子CCL5在7个高表达基因中排在首位（图4a），且在CTCs中几乎完全表达（中位数：63% vs 2%, P =0.021）（图4b）。在一个独立的HCC队列中（n=27），13名（48%）患者检测到CCL5+ CTCs，在41个CTCs中有27个（66%）是CCL5+ CTCs。CCL5+ CTCs与CCR5+ Tregs有正相关性，但与肿瘤周围血管中的CD3+ CD45RO3+/- FOXP3- T细胞无关（图4c），CCL5+ CTCs数量与CCR5+ Tregs的数量和总循环Tregs数量呈正相关（r=0.87,0.86; P <0.0001, n=27）（图4d）。Kaplan-Meier生存分析显示，与Treglow/CCL5+ CTClow、Treglow/CCL5+ CTChigh和Treghigh/CCL5+ CTClow这三组相比，Treghigh/CCL5+ CTChigh具有统计学上显著缩短的疾病复发时间（TTR）和较差的总生存期（OS）（图4e）。这些数据为团队的假设提供了强有力的临床证据，即CTCs可能通过CCL5的表达来募集Tregs以促进免疫逃逸。
图4 由CCRL2招募的chemerin介导白细胞粘附
5. Tregs通过p38-MAX通路来诱导CCL5的表达
图6为免疫逃逸机制示意图，CTC 通过 TGF-β1-p38-MAX-CCL5 信号传导的正反馈回路获得募集免疫抑制性 Treg 细胞的能力，从而促进血液和次级器官中转移有利微环境的形成。
图5 Tregs通过p38-MAX通路诱导CCL5表达
本文通过scRNA-seq构建了CTCs基因表达谱，并证实CTCs之间的空间转录异质性及转移机制。研究发现，CCL5在 CTCs中过度表达受到p38-MAX 信号调控并促使Treg的募集，从而实现CTCs在血管内免疫逃逸及转移。本文揭示了原发性肝癌的空间异质性和免疫逃逸机制，有助于为疾病治疗提供新策略。其中，文中使用了WiSee7色多重荧光试剂盒、上海媛禧生物提供多重荧光免疫组化染色服务和HALO分析。
参考文献：
Nat Commun. 2021; 12: 4091.
Published online 2021 Jul 2. doi: 10.1038/s41467-021-24386-0
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