免疫荧光技术技术流程

　　我们一起来学习一下免疫荧光技术的实验操作流程和技术细节。下面，我们首先来看一下免疫荧光技术的操作流程：

　　免疫荧光技术流程

　　细胞间接免疫荧光-IF(ICC)

　　按合适的细胞密度接种细胞爬片

　　1.弃去细胞培养液，PBS洗3次，5 min/次。

　　2.固定：4%多聚甲醛室温固定20 min，也可4℃固定过夜。

　　根据细胞室提供细胞的时间，若下午提供，那么当天不能完成实验，所以会在固定这步暂停，即4℃固定过夜;若上午提供细胞，当天可以完成全部实验，即室温固定20min。平时多数实验是室温固定20min。

　　3.PBS洗3次，5 min/次。

　　4.透膜：用含有0.3% Triton X -100的 PBS室温孵育20 min(如检测细胞膜外侧蛋白，可省略此步)。

　　5.PBS洗3次，5 min/次。

　　6.封闭：用PBS配制的5%~10%二抗来源相同种属正常血清室温封闭20 min。

　　7.PBS洗3次，3 min/次。

　　8.用Bioss标准抗体稀释液按合适比例稀释一抗，37℃下孵育2 h或4℃过夜(孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定)。

　　9.PBST洗3次，10 min/次。

　　10.用Bioss标准荧光抗体稀释液按合适比例稀释二抗，37℃下孵育1h (孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定) 。

　　11.PBST洗3次，10 min/次。

　　12.DAPI复染细胞核。

　　13.PBS洗3次，5 min/次。

　　14.取出细胞爬片置于载玻片上，镜下观察。

　　冷冻组织切片间接免疫荧光(IF-F)

　　1.制备好的冰冻切片放置于室温复温。

　　2.PBS洗3次，5 min/次。

　　3.封闭：用PBS配制的5%~10%二抗来源相同种属正常血清室温封闭20 min。

　　4.PBS洗3次，3 min/次。

　　5.用Bioss标准抗体稀释液按合适比例稀释一抗，37℃下孵育2 h或4℃过夜(孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定)。

　　6.PBST洗3次，10 min/次。

　　7.用Bioss标准荧光抗体稀释液按合适比例稀释二抗，37℃下孵育1h (孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定) 。

　　8.PBST洗3次，10 min/次。

　　9.DAPI复染细胞核。

　　10.PBS洗3次，5 min/次。

　　11.用防荧光淬灭封片剂封片，镜下观察。

　　石蜡包埋组织切片间接免疫荧光( IF-P )

　　1.制备好的石蜡切片按以下顺序进行脱腊水化

　　二甲苯І：20min，二甲苯П：20min，二甲苯Ш：20min，无水乙醇：15min，95%乙醇：15min，70%乙醇：15min，50%乙醇：15min，蒸馏水І：5min，蒸馏水II：10min。

　　2.PBS洗3次，5 min/次。

　　3.抗原修复：0.01M枸橼酸修复液(依据抗原种类不同选择合适的抗原修复液与修复方式)，沸水浴热修复15min。

　　4.PBS洗3次，5 min/次。

　　5.封闭：用PBS配制的5%~10%二抗来源相同种属正常血清室温封闭20 min。

　　6.PBS洗3次，3 min/次。

　　7.用Bioss标准抗体稀释液按合适比例稀释一抗，37℃下孵育2 h或4℃过夜(孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定)。

　　8.PBST洗3次，10 min/次。

　　9.用Bioss标准荧光抗体稀释液按合适比例稀释二抗，37℃下孵育1h (孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定) 。

　　10.PBST洗3次，10 min/次。

　　11.DAPI复染细胞核。

　　12.PBS洗3次，5 min/次。

　　13.用防荧光淬灭封片剂封片，镜下观察。

　　直接免疫荧光

　　1. 4%多聚甲醛室温固定样品20 min，也可4℃固定过夜。

　　2.PBS洗3次，5 min/次。

　　3.封闭：用PBS配制的5%~10%二抗来源相同种属正常血清室温封闭20 min。

　　4.PBS洗3次，3 min/次。

　　5.用Bioss标准荧光抗体稀释液按合适比例稀释一抗，37℃下孵育2h或4℃过夜(孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定)。

　　6.PBST洗3次，10 min/次。

　　7.DAPI复染细胞核。

　　8.PBS洗3次，5 min/次。

　　9.用防荧光淬灭封片剂封片，镜下观察。

　　以上就是关于免疫荧光技术技术流程~供参考~