免疫荧光染色少走弯路

　　讲到如何让免疫荧光染色少走弯路。提供灵敏而准确的结果，并适合多重检测，但优化还是必不可少的。

　　免疫荧光染色的操作方案呢通常是包括：固定跟透化、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、再次洗涤以及测定读数。Clark解释说：“大多数研究人员的染色方案都是一成不变的，因此呢我们建议哈在使用珍贵的样本材料时，花点时间呢去优化操作方案的每一步。”

　　Mohan指出：“就一抗孵育而言，你得考虑抗体的建议稀释度，以实现高的信背比。要是抗体浓度过低，则荧光信号比较弱，可能难以与背景区分开，但抗体浓度过高，则会导致较高的背景染色。”

Clark还提醒，千万不要低估每个步骤之间彻底洗涤的重要性。“利用生理溶液来洗涤，可以去除未结合的荧光试剂，或那些只是粘在目标上而不是特异性结合的荧光试剂，从而提高了信背比。”

 

　　选择荧光要谨慎免疫荧光技术的一个主要优势在于它为多重检测提供了机会，现在流式细胞仪能检测每个细胞中20多个离散参数。在设计多个实验时，应该考虑每个荧光基团的独特性质，如最大吸收波长and最大发射波长，消光系数and斯托克斯位移等因素。

　　Mohan表示：“人们通常要检测组织或细胞样本中的多个抗原，必须选择光谱不叠加的荧光基团。即使是最好的检测系统，也无法克服仪器和试剂之间的不匹配。”

 

　　任何实验数据的分析都依赖于相关的对照，免疫荧光染色也不例外。“不加一抗，则能说明观察到的信号是否来源于二抗与组织或细胞样本的非特异性结合，”Clark解释说。“此外，我们建议使用不表达目标的细胞或组织作为阴性对照。为了保证所有组分都正常发挥作用，那些已知表达目标的阳性对照也不能少。在荧光Western blot或ELISA技术中，含有目标抗原的蛋白或肽段合适作为阳性对照。”

　　总之呢免疫荧光染色是一种流行还很强大的检测方法。通过仔细选择荧光基团，并开发可靠的染色方案，你可以生成丰富的数据。